凝胶电泳
凝胶电泳（英语：Gel electrophoresis）或称胶体电泳，是一种用于大分子（如DNA、RNA、蛋白质）以及其碎片的分离、分析技术。该技术被科学工作者用于分离具有不同物理性质（大小、电荷、等电点）的分子。凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为预处理技术，在进行质谱、聚合酶链式反应、克隆、DNA测序或者免疫印迹等检测之前，进行分子的纯化。
凝胶电泳在用于分离核酸分子时，带有负电荷的核酸分子在外加电场的作用下穿过凝胶组成的网格。由于较小的分子更容易通过网孔，较小的分子凝胶基质中穿行地更快，并且可以移动得更远。这与分子筛的现象类似。[1]
在分离蛋白质分子时，蛋白质分子往往由于太大而不能穿过凝胶中的网孔，因此蛋白质的分离是依靠蛋白质分子上带的电荷来进行的。
除了分离核酸和蛋白质等分子，凝胶电泳还可以用于分离纳米微粒。
之所以选用凝胶而不是液体作为电泳的介质，有以下因素的考量：首先，外加电场可以引起液体的热对流，在胶体中这种对流会被抑制；其次，有的凝胶可以起到一种分子筛的作用；凝胶还可以延缓分子穿越的速度，并且能在电泳后保持分离结果，为后续的染色提供机会。[2]
物理原理 编辑
凝胶是固态的、多孔隙的交联聚合物，是整个实验进行的基质。大多数情况下，凝胶是由交联的多聚物组成的。多聚物的组成和孔隙都会根据目标分子的性质来设计。
在分离蛋白质和在分离小核酸时凝胶通常由不同浓度的丙烯酰胺和交联剂聚合而成；分离大一点的核酸时（长度超过几百个碱基），纯化的琼脂更适合作为基质。
电泳是利用电场力移动凝胶基质中的分子的一种方法。将含有待测分子的样本放入凝胶上的井（wells）中，并且施加电场，待测分子就会以不同的速率通过基质。
凝胶制备 编辑
“凝胶电泳”的第一个部分“凝胶”，是指用来分离分子的底物（matrix）。大致上凝胶是个可以被科学家控制多孔性（porosity）的交联聚合物。在分离蛋白质或小的核酸（DNA、RNA，或寡核苷酸）的时候，凝胶通常是用不同浓度的丙烯酰胺和一个交联剂聚合而成，形成不同大小网眼的聚丙烯酰胺网状系统。
分离较大的核酸（超过几百个碱基对时）较常用的底物是纯化的琼脂胶，琼脂胶是海藻（seaweed）的萃取物。
在以上两者里的凝胶都是形成固体但是具孔隙的底物，外观和触感都像透明的果冻。不像聚丙烯酰胺产物，丙烯酰胺本身是种神经毒素，需要按良好药品实验研究规范（Good Laboratory Practices，GLP）操作以避免毒性，通常一般的实验室都已经购买成品，生产方面只要交由生技工厂操作就可以。
电泳方法 编辑
第二个部分，“电泳”，是指在凝胶（琼脂糖凝胶 (Agarose)或十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）上用来推动或拉住分子的电动势（electromotive force, EMF）；将待测分子放进凝胶上的井（wells）并导入适当的电流，分子就会以不同的速率在有孔隙的胶体中移动；如果分子带负电多就会往氧化极（anode），带正电多就往还原极（cathode）移动（注意到胶凝电泳操作原理相似于电解池，氧化极带正电而还原极带负电）。在核酸（DNA或RNA）的例子里，待测分子从负电极到正电极的移动方向是因为核酸骨架上的磷酸盐携带负电。双股DNA片段自然的形成长杆状（long rods），所以核酸片段在凝胶内的移动和他们的旋转半径（radius of gyration）有关。简单的说，就是和分子大小相关。单股DNA或RNA倾向于折叠成复杂形状的分子，根据他们的三级结构以复杂的方式在凝胶内移动。因此，像是氢氧化钠或甲酰胺这类可以破坏氢键的化学物，就用来把DNA或RNA从三级结构变性，再度形成长杆状。
另一方面，蛋白质有不同的电荷和复杂的形状，所以当放电动势（EMF）在同一种蛋白质样品上，蛋白质可能会以不同的速度进入凝胶或完全不移动。所以蛋白质在有洗涤剂，如：十二烷基硫酸钠(SDS)或十二烷基磷酸钠(SDP)出现时会变性。洗涤剂会以负电荷覆盖蛋白质。通常SDS键结的量跟蛋白质的大小有关系，所以键结后变质的蛋白质带有负电荷，而且所有蛋白质有相似的“荷质比”（电荷和质量的比值）。因为变质的蛋白质移动方式像是长杆状，而不是复杂的三级结构，和SDS结合的蛋白质在凝胶内移动的速率只和它的大小有关，跟它的带电量或形状无关。
在跑完电泳，最小的分子几乎到达氧化极之后，可以对凝胶里的分子染色，这样才能看到分子。可以用溴化乙锭，银或考马斯亮蓝染色。也可以用其他方法看到凝胶里分离后的混合物组成。如果分析物的分子在紫外线下会发光，就可以在紫外线下拍出凝胶的照片。如果要分离的分子有放射性原子，凝胶可以用同位素示踪剂记录，记录方法同上面所述。
如果一开始有很多个混合物一个接一个注入相邻的“井”，跑出来的结果会是一条一条平行的轨迹〈lane〉。根据不同分子的数量，每一条轨迹都有一条或以上，明显的亮带（band），表示原本混合物分离出来的组成，每个亮带代表一个组成，组成物分离不完全就会跑出重叠的亮带，或者难以辨别的污点（smear）就表示许多组成物没有分解。
种类 编辑
参见 编辑
参考资料 编辑
- ^ Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.
- ^ Berg JM, Tymoczko JL Stryer L. Biochemistry 5th. WH Freeman. 2002. ISBN 0-7167-4955-6.
外部链接 编辑
- Biotechniques Laboratory electrophoresis demonstration, from the University of Utah's Genetic Science Learning Center
- Protein electrophoresis and Western Blotting