维基百科

桑格测序

DNA定序技術
（重定向自双脱氧链终止法）

双脱氧链终止法（英语：dideoxyribonucleotide ［簡稱 dideoxy］ chain-termination method），又称桑格法（英语：Sanger method），为一种常用的核酸测序技术，用于DNA分析，由英国生物化学家弗雷德里克·桑格于1977年发明。双脱氧链终止法与化学降解法以及其衍生方法统称为第一代DNA测序技术，为人类基因组计划所使用主要测序方法。

原理

编辑

双脱氧链终止法采用DNA复制原理。 Sanger测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物及DNA聚合酶等。 测序反应的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。

测序反应过程

编辑

早期基于Sanger法的测序设置了四个平行的测序反应，每一个反应中分别包括目标片段、DNA聚合酶、测序引物、四种dNTP和一种特定类型荧光（或放射性同位素）标记的ddNTP（即不同的反应中分别为ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP）。 通过这样的配置，在不同的反应中DNA链将会分别在A、G、C及T位中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被凝胶电泳分开并显示出来。变性丙烯酰胺电泳有四个泳道，每个泳道对应一种碱基。电泳结束后通过放射自显影或紫外显影可读出X光片或凝胶影像。图像中的每一个暗带表示一个双脱氧核苷酸（ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP）掺入后链终止的DNA片段的结果。四个泳道之间的不同暗带的相对位置可以用来读取（从底部到顶部）DNA序列，从而得到该目标片断的碱基排列顺序。如图A所示，该DNA片段的序列顺序为ATGCTTCGGAT。

随着Sanger测序技术的发展，ddNTP的标记技术有了很大的提高。不同种类的ddNTP可以被不同荧光基团所标记，而这些荧光基团具有相同的激发波长和不同的发射波长，因而在光学上表现为不同的颜色。因此，测序反应可以在一个体系中进行，满足了业界对测序速度、自动化及通量不断提高的要求。如图B所示，原本四个不同的测序反应被单一测序反应所取代。

 
Sanger测序法电泳结果示例

自动化测序仪

编辑

桑格法操作简便，因此被广泛使用，在其基础上衍生出荧光自动测序技术等。基于荧光标记和双脱氧链终止法的荧光自动测序仪被广泛使用，用于人类基因组计划等项目。 基于毛细管电泳技术，Sanger测序现在已经可以在高度自动化的测序仪中进行，商用的产品包括Life Technologies的3130xL、3730xL、3500Dx与3500Dx xL测序仪及Beckman的GeXP遗传分析系统等。这类系统最长可测定600-1000bp的DNA片段，且对重复序列和多聚序列的处理较好，序列准确性高。但是，这类测序仪在24h内可测定的DNA分子数一般不超过10,000个，通量较低，每碱基测序成本较高，不适合大规模平行测序。其中ABI的3500Dx系列最近获得美国FDA、欧盟与中国SFDA批准，成为第一台进入临床使用的基因测序仪。

参考文献

编辑

参见

编辑
检索自“https://zh.wikipedia.org/w/index.php?title=桑格测序&oldid=83794447”