桑格测序
双脱氧链终止法（英语：dideoxyribonucleotide ［簡稱 dideoxy］ chain-termination method），又称桑格法（英语：Sanger method），为一种常用的核酸测序技术，用于DNA分析，由英国生物化学家弗雷德里克·桑格于1977年发明。双脱氧链终止法与化学降解法以及其衍生方法统称为第一代DNA测序技术，为人类基因组计划所使用主要测序方法。
原理 编辑
双脱氧链终止法采用DNA复制原理。 Sanger测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物及DNA聚合酶等。 测序反应的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。
测序反应过程 编辑
早期基于Sanger法的测序设置了四个平行的测序反应，每一个反应中分别包括目标片段、DNA聚合酶、测序引物、四种dNTP和一种特定类型荧光（或放射性同位素）标记的ddNTP（即不同的反应中分别为ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP）。 通过这样的配置，在不同的反应中DNA链将会分别在A、G、C及T位中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被凝胶电泳分开并显示出来。变性丙烯酰胺电泳有四个泳道，每个泳道对应一种碱基。电泳结束后通过放射自显影或紫外显影可读出X光片或凝胶影像。图像中的每一个暗带表示一个双脱氧核苷酸（ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP）掺入后链终止的DNA片段的结果。四个泳道之间的不同暗带的相对位置可以用来读取（从底部到顶部）DNA序列，从而得到该目标片断的碱基排列顺序。如图A所示，该DNA片断的序列顺序为ATGCTTCGGAT。
随着Sanger测序技术的发展，ddNTP的标记技术有了很大的提高。不同种类的ddNTP可以被不同荧光基团所标记，而这些荧光基团具有相同的激发波长和不同的发射波长，因而在光学上表现为不同的颜色。因此，测序反应可以在一个体系中进行，满足了业界对测序速度、自动化及通量不断提高的要求。如图B所示，原本四个不同的测序反应被单一测序反应所取代。
自动化测序仪 编辑
桑格法操作简便，因此被广泛使用，在其基础上衍生出荧光自动测序技术等。基于荧光标记和双脱氧链终止法的荧光自动测序仪被广泛使用，用于人类基因组计划等项目。 基于毛细管电泳技术，Sanger测序现在已经可以在高度自动化的测序仪中进行，商用的产品包括Life Technologies的3130xL、3730xL、3500Dx与3500Dx xL测序仪及Beckman的GeXP遗传分析系统等。这类系统最长可测定600-1000bp的DNA片段，且对重复序列和多聚序列的处理较好，序列准确性高。但是，这类测序仪在24h内可测定的DNA分子数一般不超过10,000个，通量较低，每碱基测序成本较高，不适合大规模平行测序。其中ABI的3500Dx系列最近获得美国FDA、欧盟与中国SFDA批准，成为第一台进入临床使用的基因测序仪。
参考文献 编辑
- 解增言，林俊华，谭军，舒坤贤. 《DNA测序技术的发展历史与最新进展》. 《生物技术通报》，2010年08期.
- 宋一鸣，石成华. 《以双脱氧链终止法测定dG、dC接尾的cDNA克隆序列》. 《遗传》，1988年01期.
- Niedringhaus TP et al. Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies, Anal. Chem., 2011, 83 (12), pp 4327–4341, DOI: 10.1021/ac2010857
- Life Technologies 3500基因分析仪获国家药监局批准并宣布其与达安基因组建的合资公司推出 10 种检测试剂盒 https://web.archive.org/web/20131110070420/http://prnasia.com/story/76962-1.shtml