埃德曼降解法
Edman降解（埃德曼降解，英語：Edman degradation），也根據所使用試劑而被稱為「PTC法」或「PTH法」，是肽鏈或蛋白質中N-端氨基酸序列分析方法之一。由菲爾·埃德曼（Pehr Edman）首先創立。[1]
機理
編輯
用異硫氰酸苯酯（Phenylisothiocyanate, 縮寫：PITC）與待分析多肽的N-端氨基在鹼性條件下反應，生成苯硫脲（PTC）的衍生物，於酸性條件之下生成五元環，肽鏈N-端被選擇性地切斷，得到N-端氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有機溶劑將該衍生物萃取出來，酸作用下，該衍生物不穩定，會繼續反應，形成一個穩定的苯基乙內酰硫脲（PTH）衍生物。餘下肽鏈中的酰胺鍵不受影響。通過用HPLC或電泳法分析生成的苯乙內酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鑑定出是哪一個氨基酸。每反應一次，結果是得到一個去掉N-端氨基酸殘基的多肽，剩下的肽鏈可以進入下一個循環，繼續發生降解。
在1967年就出現了實現根據此原理設計的自動化儀器。[2]利用自動分析儀進行分析時，能夠可靠地測定肽鏈的30個左右氨基酸殘基序列，最多可以分析50-60個氨基酸殘基。在最好的條件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少，一般只用10-100皮摩爾的多肽即可測定氨基酸序列。對於肽鏈較長的多肽，可以先將肽鏈切斷成多個小肽，對這些小肽進行氨基酸分析，然後將這些信息拼接起來，得到起始肽鏈中的氨基酸序列。
限制
編輯由於Edman降解是以化學試劑對N-端氨基的修飾為基礎的，因此當N-端被其他化學基團所封閉時，就需要先去除這些基團，然後才能進行測序。此外，蛋白質中含有半胱氨酸殘基時，有時兩個半胱氨酸殘基會發生二硫鍵交聯。這種情況下，需要先用過酸將二硫鍵氧化為–SO3H，然後才能用Edman降解測定序列。
另外，由於所有反應都在封閉或體外的環境之下，勢必會達到平衡，因此若在第一個試管裡加入PITC，它會和試管內的第一個氨基酸的N-端氨基結合，可是由於平衡原理：PITC + 一段氨基酸序列 = PITC-氨基酸 + 少了第一個氨基酸的氨基酸序列，因此在第一個試管裡會同時存在沒有結合PITC和有結合PITC的氨基酸序列，這會導致我們將第一管有PITC-氨基酸的物質分離後，繼續在第二個試管裡加入PITC，則此時第二個試管裡會含有少量的PITC-氨基酸(1)和多量的PITC-氨基酸(2)。這時候我們可以利用聯用質譜法(Tandem mass spectrometry （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）)等技術來分析，若分析後發現量多者為PITC-氨基酸(2)，量少者則為PITC-氨基酸(1)，因此我們就解決了反應不完全的問題。而另外一個問題也隨之衍生，一旦我們不停地重複此步驟，得到氨基酸的序列時，一直到約第50個試管開始，就會發現所以氨基酸的量經分析後都會變得幾乎一樣，這樣我們就沒有辦法可以知道氨基酸的序列。這也就是為什麼我們需要先將一段大於50個氨基酸的序列用水解酶給進行切割，讓所有片段的氨基酸序列小於50，這樣我們才可以得到比較準確的氨基酸序列。
參見
編輯參考資料
編輯- ^ Edman, Pehr; Högfeldt, Erik; Sillén, Lars Gunnar; Kinell, Per-Olof. Method for Determination of the Amino Acid Sequence in Peptides.. Acta Chemica Scandinavica. 1950, 4: 283–293. ISSN 0904-213X. doi:10.3891/acta.chem.scand.04-0283.
- ^ Edman, P.; Begg, G. A Protein Sequenator. European Journal of Biochemistry. 1967, 1 (1): 80–91. ISSN 0014-2956. doi:10.1111/j.1432-1033.1967.tb00047.x.