柱色譜法
管柱層析法（英語：Column chromatography，又稱為柱層析，俗稱過柱子[1][2]）是一種製備性色譜（Preparative chromatography），在化學中是最為常用的從混合物中分離純淨物的分離方法。不同分子具不同大小、電荷、附着力，這些差異可以幫助分離從毫克到公斤級別的產物。柱色譜的主要優點是相對的低成本和可處理的固定相，選用的固定相可以避免重複利用的交叉污染和固定相的分解。
操作
編輯
常見的製備性色譜柱是直徑5mm至50mm的管狀玻璃儀器，高5mm至1m，底部有旋塞，柱體底部間通常塞有多孔玻璃塊或玻璃纖維以支撐填料。色譜柱的裝填主要有兩種方法：
- 干法裝填。首先往柱體裝入乾燥的固定相粉末，然後自頂部加入流動相溶劑，沖洗直至整個固定相被溶劑浸沒。
- 濕法裝填。首先將固定相和流動相溶劑混合製成懸濁液，關閉色譜柱旋塞，柱體豎直，均勻地將懸濁液倒入，注意不能產生氣泡。傾倒最好一次完成，否則固定相間斷層影響分離效果。等待片刻，固定相沉降，有時用塑膠球輕敲柱體幫助固定相堆積密實。裝填完成後頂端自然留有一段溶劑。
固定相裝填完畢後，通常在其頂端鋪上一小層硅藻土、玻璃纖維或棉花等材料，用來保護固定相頂層的形狀不被流體攪亂。將液面調節至固定相頂端以上，硅藻土頂端附近，小心滴加含有待分離物質的溶液。溶劑自柱色譜上口補充，同時打開下旋鈕開始洗脫。分離過程中必須保持液面在固定相頂端以上，否則將會出現氣泡和裂縫。[3]如果發生干柱，吸附在固定相中的產物可能很難沖洗下來，需拆下使用溶劑溶解，造成時間上的消耗和產物上的損失。由於分離時間通常較長，有時在柱頂加上一溶劑球，或裝滿溶劑的分液漏斗，以保持液面可以持續高於柱頂一段時間，而不必一直在旁值守。
使用一系列按次序編號的錐形瓶或試管等接收溶劑，由於各組分通過固定相速度的差異，流出時間有差別，於是不同組分被分離到不同編號的容器中。通過旋轉蒸發等手段濃縮產物。並且，較長時間的柱色譜分離可能耗費大量溶劑，旋蒸過後的溶劑可拿來重複使用。
對於有色物質的分離，可通過流出序列顏色判斷產物位置，[4]然而，多數情況需要藉助分析性色譜的方法判斷。常用的方法例如取一組流出液點板，進行薄層色譜分析，矽膠板置於紫外燈下，從產物熒光判斷組分。
可同時操作數根色譜柱以提高分離效率，多通道收集器可實現區分不同組分的流出液，其原理為通過紫外-可見分光光度法或熒光光譜監控流出液的組分。已有快速製備色譜儀實現自動化的分離和組分檢測。[2]
固定相
編輯固定相通常為吸附性的粉末狀固體。最常用的固定相是矽膠，其次是氧化鋁。過去也有使用纖維素的。除此之外，離子交換色譜法、反相色譜法、親和色譜法、擴張床吸附也可用於柱色譜。固定相與待分離物質乾重之比是一個評估固定相效率的重要參數，對於矽膠，這一比值在20:1到100:1之間，取決於待分離物保留因子的接近程度。[5]
流動相
編輯流動相或稱洗脫劑，可以是單組份的純溶劑，但更多情況下選用一定比例的混合溶劑。流動相的選擇對柱色譜分離至關重要。溶劑配比或根據文獻，自己嘗試時則需綜合考慮產物和溶劑極性等因素。極性產物能被極性溶劑洗脫，而非極性產物能被非極性溶劑洗脫。[3]常使用薄層色譜法（TLC）測試各組分的保留因子，以確定固定相溶劑種類和配比。通常，保留因子在0.2至0.3之間較為合適，平衡了分離效率和溶劑消耗量。
流動相的流出速率影響分離的效果。較快的速率能縮短實驗時間，並且減少擴散，因而使得分離效果更好。然而流速也不是越快越好，因為固定相和流動相之間平衡需要時間。范第姆特方程對影響分離效果幾種主要因素進行了總結，根據此方程，流速當有一最優值。簡單的柱色譜利用重力驅動洗脫，調節旋鈕減慢流速，或者在柱頂加上溶劑球增加壓力加快流速。需要更快的流速時，可使柱頂與泵或壓縮氣體（例如空氣、氮、氬）相通，在液面以上加壓，這種方法稱為快速柱色譜（flash column chromatography）。[6][7]
快速柱層析中的固定相粒徑較 平時做管柱層析時所使用的顆粒 小。前者最常用的粒徑為230 – 400目 (40 – 63 µm)，而後者通常為70 – 230目(63 – 200 µm)。[8]
自動化系統
編輯
柱色譜是化學實驗室中極為耗時的步驟，以至於成為實驗室工作的效率瓶頸。基於此現狀，很多實驗室儀器製造商，包括Biotage、Buchi、Interchim和Teledyne Isco等公司已經開發了自動化的快速柱色譜系統，稱為LPLC（low pressure liquid chromatography，低壓液相色譜儀，工作壓力350—525 kPa或50.8—76.1 psi），以期人力投入的最小化。LPLC通常含有更昂貴的高效液相色譜（HPLC）的組件，包括梯度泵，樣品注入端口，UV檢測器和餾分收集器。LPLC可分離毫克至千克級的產物，對於原本需要HPLC多次進樣的情況提供更廉價的解決方案。
參考資料
編輯- ^ 过柱子是什么意思？柱子乾;, original = 干了为什么可怕？. 網易新聞中心. 2015-07-20 [2017-01-29].
- ^ 2.0 2.1 上海科技大学自动过柱机（自动纯化系统）中标公告. 中國政府採購網. 2016-09-28 [2017-01-29]. （原始內容存檔於2018-10-04）.
- ^ 3.0 3.1 關燁第. 有机化学实验 第二版. 北京大學出版社. 2002年10月. ISBN 7301058594.
- ^ 江洪. 基础有机化学实验. 科學出版社. 2015年7月: 74. ISBN 9787030449870.
- ^ Setting up a flash chromatography column. [2017-02-11]. （原始內容存檔於2017-07-16）.
- ^ Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978, 43(14), 2923-2925. (doi:10.1021/jo00408a041)
- ^ Laurence M. Harwood, Christopher J. Moody. Experimental organic chemistry: Principles and Practice Illustrated. 13 Jun 1989: 180–185. ISBN 978-0-632-02017-1.
- ^ Normal phase column chromatography, Material Harvest （頁面存檔備份，存於互聯網檔案館）