蛋白質純化

蛋白質純化是指將一種或幾種蛋白質從複雜的混合物（通常是細胞、組織或整個器官）中分離的一系列過程。對於表徵蛋白質功能、結構和相互作用來說，蛋白質純化是十分重要的一步。蛋白質純化過程能夠分離混合物的蛋白質和非蛋白質部分，最後將所需蛋白質與所有其他蛋白質分離。將一種蛋白質與其他蛋白質分離通常是蛋白質純化中最費力的方面。分離步驟通常利用蛋白質大小，物理化學性質，結合親和力和生物活性的差異。純化結果可稱為蛋白質分離物。

目的

蛋白質純化可以用於蛋白質製備或者分析。製備性純化目的是獲得相對大量的純化蛋白用於後續使用，包括一些商業產品的製備，諸如酶（例如乳糖酶），營養性蛋白質（例如大豆蛋白分離物）和某些生物藥物（例如胰島素）。一些製備性純化也通常被用來去除副產物，例如會對患者健康構成潛在威脅的宿主細胞蛋白。分析性純化則是通過獲得少量的蛋白質，並將其用於各種研究或分析，包括蛋白質的識別、定量分析以及蛋白質結構和翻譯後修飾、功能的研究。胃蛋白酶和脲酶是第一批被純化到可以結晶的蛋白質。

預處理

可在含有培養基的錐形瓶中培育重組細菌

提取

如果目標蛋白質並非直接被生物體分泌到周圍的溶液中，那麼通常純化過程的第一步是破壞含有蛋白質的細胞。根據蛋白質的脆弱程度和細胞的穩定程度，可從以下方法中選擇一種：（1）反覆反覆凍融、（2）超聲處理、（3）高壓均質化（法壓）、（4）通過研磨（珠磨機）均質化、和（5）通過洗滌劑（例如Triton X-100）和/或酶（例如溶菌酶）進行通透化。最後，通過離心除去細胞碎片，使蛋白質和其他可溶性化合物保留在上清液中。

細胞裂解過程中也會同時釋放出的蛋白酶，並消化分解溶液中的蛋白質。如果目標蛋白質對易水解，建議儘快進行此步驟，並保持低溫，以減緩蛋白質分解速度。或者，可以在細胞破碎之前立即將一種或多種蛋白酶抑制劑加入裂解緩衝液中。有時還需要添加去氧核糖核酸酶（DNA酶）以降低由於含有大量DNA而引起的細胞裂解物的粘度。

沉澱與差異化溶解

在大量蛋白質純化中，通常第一步是用硫酸銨${\textstyle {\ce {(NH4)2SO4}}}$沉澱的方式來分離蛋白質。該方法通過逐漸增加硫酸銨的添加量，收集每一部分產生的沉澱蛋白質。最後硫酸銨可以通過透析除去。蛋白質上的疏水基團暴露在外界環境中，吸引其他蛋白質疏水基團然後聚集在一起。沉澱的蛋白質通常足以肉眼可見。該方法的一個優點是可以廉價地大量獲得蛋白質。

純化蛋白質過程中首先得到的是水溶性蛋白質。整合膜蛋白的純化需要破壞細胞膜，以便將某一特定蛋白質與同一膜結構中的其他蛋白質分離。有時可以首先分離特定的膜結構，例如在純化位於線粒體膜中的蛋白質之前，從細胞中分離線粒體。某些去污劑（諸如十二烷基硫酸鈉（SDS））可用於溶解細胞膜並在純化過程中將膜蛋白保留在溶液中；然而，由於SDS會導致蛋白質變性，一般在完全純化過程中使用較溫和的洗滌劑（如Triton X-100或CHAPS）來保持蛋白質的天然構象。