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考馬斯亮藍

化合物

考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）是兩種三苯甲烷衍生物染料（G-250和R-250）的統稱，起初開發用於紡織行業，但現在通常用於分析生物化學中的蛋白質染色。考馬斯亮藍G-250比考馬斯亮藍R-250多兩個甲基。其名「考馬斯」是帝國化學工業下的一個註冊商標。

考馬斯亮藍R-250
Skeletal formula of Coomassie Brilliant Blue R-250
Space-filling model of the Coomassie Brilliant Blue R-250 molecule
別名 C.I. 42660, C.I. Acid Blue 83
Brilliant indocyanine 6B, Brillantindocyanin 6B
Brilliant Cyanine 6B, Serva Blue R
識別
CAS號 6104-59-2  checkY
PubChem 61365
SMILES
 
  • CCN(CC1=CC(=CC=C1)S(=O)(=O)[O-])C2=CC=C(C=C2)C(=C3C=CC(=[N+](CC)CC4=CC(=CC=C4)S(=O)(=O)[O-])C=C3)C5=CC=C(C=C5)NC6=CC=C(C=C6)OCC.[Na+]
性質
化學式 C45H44N3NaO7S2 (Sodium salt)
摩爾質量 825.97 g/mol g·mol⁻¹
溶解性（水） Insoluble in cold, slightly soluble in hot (bright red blue)
溶解性（ethanol） Slightly soluble
若非註明，所有數據均出自標準狀態（25 ℃，100 kPa）下。
Coomassie Brilliant Blue G-250
別名 C.I. 42655, C.I. Acid Blue 90
Brilliant indocyanine G, Brillantindocyanin G
Xylene Brilliant Cyanine G, Serva Blue G
識別
CAS號 6104-58-1
PubChem 6324599
SMILES
 
  • CCN(CC1=CC(=CC=C1)S(=O)(=O)[O-])C2=CC(=C(C=C2)C(=C3C=CC(=[N+](CC)CC4=CC (=CC=C4)S(=O)(=O)[O-])C=C3C)C5=CC=C(C=C5)NC6=CC=C(C=C6)OCC)C.[Na+]
KEGG D10799
性質
化學式 C47H50N3NaO7S2 (Sodium salt)
摩爾質量 856.03 g/mol g·mol⁻¹
溶解性（水） Slightly soluble in cold, soluble in hot (bright blue)
溶解性（ethanol） Soluble
若非註明，所有數據均出自標準狀態（25 ℃，100 kPa）下。

起名和發現

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考馬斯這個名字最初在19世紀末被一家設在英國布萊克利（Blackley）的染料公司（Levinstein Ltd.）作為貿易名使用，用來售賣一些酸性羊毛染料。[1]

1896年在第四次英國-阿散蒂戰爭期間, 英國軍隊占據了考馬斯鎮（今加納庫馬西）。

1918年， Levinstein Ltd.公司併入不列顛染料公司（British Deystuffs Cororation) ，後者在1926年成為帝國化學工業的一部分。[2]雖然帝國化學工業公司仍然持有考馬斯這種商標，可是他們沒有再生產這種染料。

這些藍色的二磺酸化三苯甲烷的染料首先在1913年由住在德國Elberfeld的Max Weiler生產[3]後來陸續發現了多種有機化學合成這種染料的方法。Var[4][5][6]目前發表的生化論文中，通常把這些染料統稱「考馬斯」而不區分具體用的是哪種染料。實際上國際顏色索引列出了超過了四十種名字含有「考馬斯」的染料，也有一些其他種類的（非二磺酸化三苯甲烷）的染料，也被叫作「考馬斯」藍。例如默克索引（第10版）列出了具有完全不同的結構的考馬斯藍。

染料的顏色

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後綴帶R的考馬斯亮藍R-250，R意指紅色，這是因為考馬斯亮藍R-250在藍色中略帶有紅色；而G型則意指Green，在藍色中帶有一點綠色。250起初是指染料的純度。

這兩種染料的顏色與溶液的酸堿性有關。考馬斯亮藍G型已經研究得比較詳細。[7] 在pH低於0的時候，呈現紅色，最大吸收峰位於465nm。在pH值約為1時，這種染料呈現綠色，最大吸收峰位於約620nm處。當pH高於2時，這種染料呈現一種亮藍色，最大吸收峰位於595nm。在pH為7的時候，這種染料的莫耳吸光度是43,000 M−1cm−1.[7]

染料分子呈現不同顏色的原因是分子不同的帶電荷狀態。在紅色形態時，全部三個氮原子均帶有正電。兩個磺酸基團有相當低的酸度係數，通常會帶負電，因而在pH為0左右時，整個染料分子會帶1個正電荷。綠色的形態則對應整體不帶電荷。而在中性介質（pH7）中，僅有二苯胺官能團上的氮原子帶有一個正電荷，所以整個分子帶有一個負電荷而呈藍色。這三個氮原子中前兩個失去質子的pKa分別是1.15和1.82。最後一個氮原子在強堿性環境下會失去質子，從而使染料變為粉色（pKa是12.4）[7]。

考馬斯亮藍和蛋白質的氨基、羧基基團產生靜電作用，而非共價作用。染料分子和蛋白分子包括羊毛（角蛋白）形成一個蛋白質-染料分子複合物。 這種複合物的形成，使得染料的帶負電荷的形態得到了穩定，從而產生藍色，即使在多數分子帶正電荷的強酸環境下。[7] 這是布拉德福蛋白質定量法的理論依據，是一種利用考馬斯亮藍與蛋白質結合的蛋白質測定方法。這種染料與蛋白質的結合，使得考馬斯亮藍的吸收峰從465nm遷移到595nm。記錄595nm處吸光度的增加，可以用來測定蛋白質濃度。[8]

這種染料也會與陰離子去垢劑十二烷基硫酸鈉形成複合物。[9]這使得染料分子的綠色形態得到穩定。這個效應可以干擾布拉德福蛋白質定量法的測定。陰離子去垢劑也有可能與蛋白質競爭和染料分子結合。

生物化學中的用途

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考馬斯亮藍R-250在1964年被Fazekas de St.Groth的團隊最先用來觀察蛋白。蛋白樣品在醋酸纖維素薄膜上進行電泳分離。薄膜隨後被放置於5-磺基水楊酸中，使蛋白質條帶固定，然後將膜浸到染料溶液中。[10]

兩年之後，1965年Meyer和Lambert用考馬斯亮藍R-250去染經聚丙烯酰胺凝膠分離的蛋白質樣品。他們將膠浸在含有甲醇乙酸和水的溶液中。由於染料在染色蛋白質的同時也染了聚丙烯酰胺凝膠，為了使蛋白質條帶可見，他們對電泳的凝膠進行了脫色。[11]後續的文獻報道聚丙烯酰胺凝膠可以被乙酸溶液成功脫色。

在1967年，首次出現使用考馬斯亮藍G讓聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白條帶變得可見的報道，其中染料被溶解在含有甲醇的乙酸溶液中。[12]之後發現，如果使用溶解在不含甲醇的三氯乙酸考馬斯亮藍G膠體，可以使蛋白質條帶被染色，而聚丙烯酰胺不被染色。如果用這種方法，就沒有必要再對膠進行脫色。[13]現代的手段通常是將考馬斯亮藍G溶解在含有磷酸、乙醇（或甲醇）和硫酸銨（或硫酸鋁）的溶液中。[14][15][16][17]

布拉德福蛋白質定量法利用了考馬斯亮藍G-250的光譜性質去檢測溶液中的蛋白質含量。[18]將蛋白質樣品加入到染料的磷酸和乙醇的溶液中。在酸性環境中，這種染料通常呈現棕紅色，但是結合了蛋白質之後，染料形成藍色形態。溶液的吸光度在595nm波長處測定。這種染料非常著名，因為它有高靈敏性，即使只有5μg蛋白也足以使染料變色。然而，這種方法有一個缺點是變色程度因蛋白質種類不同而不同：單位量蛋白質帶來的吸光度改變取決於蛋白質的類型。[19]

與蛋白質結合後，帶負電荷的考馬斯亮藍G-250分子會讓蛋白質整體帶上負電荷。這個性質可以被用來分離蛋白質或蛋白質複合物，使用非變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳——Blue Native PAGE電泳。[20][21]這樣的複合體的遷移能力既取決於蛋白質複合體的分子質量，也取決於結合到蛋白質上的染料量。

考馬斯亮藍染色，也可以用於western印跡分析中的一步。[22]它的作用是先於抗體的染色，使之可以作為對照。

藥理用途

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2009年，考馬斯亮藍G在實驗中被用來治療實驗室大鼠的脊髓損傷。[23]它通過減少個體腫脹反應而生效，而腫脹反應會導致損傷區域的神經元死於代謝的壓力。這個方法在大鼠上測試有效。兩組脊髓損傷大鼠中，一組給予考馬斯亮藍G處理，一組沒有處理。測試結果證明，相較於沒有處理的大鼠，用染料處理的大鼠可以更好的運動，並且在運動測試中取得更高的得分。[24] 這種治療能否用在人類身上的相關測試還在進行中。近期的實驗中曾在損傷後15分鐘後，施予染料治療有效。但是在現實生活中，病人需要一定時間才能趕到急救室，所以這種治療應該即使在受傷後兩小時後施放仍然有效。唯一報道的副作用是大鼠會短暫的變藍。[23][25][26]

亮藍G作為染料可以被外科醫生使用來完成視網膜手術，它的貿易名是Brilliant Peel.[27]

法醫學應用

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紐約州立大學奧爾巴尼分校的一個實驗，反應了考馬斯染料可以去靶向結合芳香族氨基酸（苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸）和鹼性側鏈氨基酸（賴氨酸，精氨酸和組氨酸），從而使得布拉德福分析可以用來做指紋的分析。布拉福德分析已經可以成功的用來檢測指紋的男女屬性。女性指紋樣品相較於男性指紋樣品，會帶來更高的吸收峰（在相近波長下）。這提供了一種更簡單的指紋分析方法，將需要分析的氨基酸數從23個減少到了6個，而且相對於茚三酮化學測定方法，需要的準備工作量更少，因為茚三酮測定法需要加熱、酶聯反應等。[28]

參考文獻

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  28. ^ Brunelle, Erica; Le, Anh Minh; Huynh, Crystal; Wingfield, Kelly; Halámková, Lenka; Agudelo, Juliana; Halámek, Jan. Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye: An Application for Forensic Fingerprint Analysis. Analytical Chemistry. 2017-04-04, 89 (7): 4314–4319. ISSN 0003-2700. doi:10.1021/acs.analchem.7b00510. 

延伸閱讀

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  • Gessner, T.; Mayer, U. Triarylmethane and Diarylmethane Dyes. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry 6th Edition. Weinheim: Wiley-VCH. 2002. ISBN 3527306730. doi:10.1002/14356007.a27_179{{inconsistent citations}} 

外部連結

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